近年來規(guī)模化牧場已成為生產(chǎn)主體，牛奶的規(guī)模化生產(chǎn)能夠保證奶牛、飼料、技術等的一致性，但不同地區(qū)的環(huán)境因素仍會造成牛奶中脂肪、蛋白質等品質指標存在差異，進而導致不同牧場牛奶之間的風味差異。牛奶風味是決定消費者購買與否的重要因素之一。目前關于牛奶風味的研究大多集中在不同殺菌方式的比較方面，對于不同地區(qū)牧場牛奶風味差異的研究較少。
        本研究以4個不同感官特性牧場的牛奶為研究對象，采用CATA法、GC-MS以及GC-MS-O聯(lián)用技術研究了牛奶的感官特征和揮發(fā)性風味物質。采用單因素方差分析、對應分析（CA）和偏最小二乘回歸（PLSR）等方法，分析影響不同牧場牛奶感官差異的香氣活性化合物，以期為實際乳品工業(yè)中的牛奶感官品質的控制提供進一步的理論參考。
        一、材料與方法
        01 材料與試劑
        從河北的6個牧場獲取6份牛奶樣品，通過初步感官評價（數(shù)據(jù)未顯示）篩選出4種感官差異較大的牛奶樣品，分別標記為一牧、二牧、三牧、四牧（表1）。
        02 揮發(fā)性風味物質的提取
        利用SPME-Arrow萃取頭進行風味化合物的萃取，并對提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化。經(jīng)優(yōu)化后的條件：10g樣品置于40mL的頂空瓶中，向其中加入1g氯化鈉提高萃取效率，并向其中添加1μL質量濃度為0.816mg/mL的2-甲基-3-庚酮作為內標。在45℃水浴鍋中平衡20min后，利用SPME-Arrow的萃取頭吸附30min，在GC-MS中解吸5min。
        03 GC-MS條件
        色譜條件：DB-WAX型毛細管柱（60m×0.25mm，0.25?μm），以氦氣作為載氣，設置恒定流速1.2mL/min。升溫程序：起始柱溫為40℃，以4℃/min升溫到230℃，維持2min。采用不分流模式。
        質譜條件：電子電離（electronionization，EI）源，電子能量70eV；進樣口溫度250℃，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃；全掃描模式，質量掃描范圍m/z35～350。
        04 GC-MS-O條件
        采用配備嗅覺檢測端口的GC-MS。高純氮氣（99.99%）作為GC-O分析的載氣。嗅聞口與質譜儀進樣分流比1∶1，嗅聞口和傳輸線的溫度分別保持在230℃和250℃，在檢測口通入濕潤的空氣。其他條件同1.3節(jié)GC-MS條件。由4名有牛奶感官經(jīng)驗的小組成員進行，針對牛奶香氣物質對評價員進行額外12h培訓（每周3h，共4周）。嗅聞時，實時記錄香氣化合物出現(xiàn)的時間、氣味特征以及氣味強度（aromaintensity，AI）。參考文獻方法并進行調整，將AI分5個等級，分別以0、1、2、3、4分的形式表示香氣強度，“0”表示未識別到任何氣味，“1”表示可以準確識別氣味但持續(xù)時間短，“2”表示能快速識別氣味且持續(xù)時間長，“3”表示能準確快速識別氣味且持續(xù)時間較長，“4”表示能準確快速識別氣味且持續(xù)時間更長。如果2個及其以上的小組成員感知到氣味，就確定一個香氣活性物質。
        05 定性定量分析
        采用NIST14譜庫、計算化合物的保留指數(shù)（retentionindex，RI）與文獻中的保留指數(shù)進行對比以及比對嗅聞結果對牛奶中化合物進行定性分析。RI計算：將正構烷烴C7～C30與牛奶在相同的色譜條件下得出GC保留時間，根據(jù)公式計算待測物i的RI（tn＜ti＜tn＋1）：
        式中：n為碳原子數(shù)；tn為碳原子數(shù)為n的正構烷烴的保留時間；tn＋1為碳原子數(shù)為n＋1的正構烷烴的保留時間；ti為樣品i的保留時間。
        定量分析：內標半定量法，根據(jù)化合物及內標化合物峰面積比值計算各揮發(fā)性組分的濃度。對嗅聞得到的香氣活性物質進行內標標準曲線法（內標為2-甲基-3-庚酮）精確定量。
        06 感官評價
        從北京工商大學學生中招募到50名未經(jīng)培訓的消費者（18名男性和32名女性，年齡19～25歲）完成CATA問卷（圖1）。實驗開始前，每個參與者都簽署了一份知情同意書，參與者均具有長期飲用牛奶的習慣（每周至少5次）。并對招募的消費者評價員進行實驗所需的流程介紹以及感官評價等基本知識培訓。
        CATA問卷中的感官屬性在文獻及實驗室感官評價專家小組討論確定的基礎上，再由10名消費者集體討論，根據(jù)樣品本身的屬性以及參與者的語言習慣對描述詞進行調整后最終確定。在回答完每個評估樣本的CATA問題后，參與者還需要使用1～9分的享樂量表對樣品的總體喜愛程度進行評分。
        將4份15mL的牛奶樣品置于30mL的品評杯中。樣本隨機3位數(shù)編碼呈送給參與者。期間還提供了無鹽餅干和瓶裝凈水清潔口腔。
        07 數(shù)據(jù)處理
        采用單因素方差分析比較GC-MS測得的揮發(fā)性風味物質的半定量及精確定量結果，并采用Tukey事后比較法進行統(tǒng)計學分析（以P＜0.05表示差異顯著）。CATA數(shù)據(jù)以感官屬性的頻率表示，通過具有顯著差異的氣味描述詞進行CA，將氣味屬性的頻率和4個牛奶樣本之間的相關性可視化。使用PLSR，以探索CATA氣味感官屬性（頻率）與香氣活性物質之間的關系。利用IBMSPSSStatistics23、SIMCA14及Origin2018等軟件進行數(shù)據(jù)處理及圖像繪制。
        二、結果與分析
        01 牛奶樣品的感官分析
        50名參與者通過CATA問卷對牛奶樣品的感官屬性進行勾選，表2顯示了4個牛奶樣本的22個感官屬性描述詞的使用頻次，包括10個氣味、4個滋味、4個口感和4個外觀。其中描述氣味的奶香味、奶油味，描述滋味的甜味，描述口感的醇厚以及描述外觀的流動性好為參與者勾選最多的描述詞，而氣味描述詞紙板味，滋味描述詞回味-澀味、口感描述詞顆粒感和外觀描述詞流動性差則是勾選頻率最低的。由表3可知，4個牧場牛奶樣品喜好度評分均存在顯著差異（P＜0.05）。以上表明參與者傾向于使用奶香味、奶油味、甜味變量描述牛奶樣品的風味，它們是牛奶中普遍存在的風味屬性，也是消費者所喜愛的風味屬性。
        此外，根據(jù)Cochran’sQ-test，在10個氣味屬性中，50位參與者能夠顯著區(qū)分4個牛奶樣品中的7個氣味屬性，分別為奶香味、奶油味、香甜味、奶腥味、塑料味、蒸煮味、金屬味，在回味-奶香味、氧化味和紙板味的氣味屬性上沒有顯著差異。利用CA將7個氣味屬性與來自4個牧場的牛奶樣品之間的關系可視化（圖2）。CA的結果顯示F1和F2的總解釋量為96.25%。一牧牛奶樣本位于第2象限，與奶油味和奶香味CATA變量呈正相關，且喜好度評分最高（表3）。二牧位于第3象限，與香甜味有關。三牧則位于第1象限，其喜好度評分最低，與金屬味、塑料味呈正相關，而四牧位于第4象限，與奶腥味、蒸煮味、氧化味等不愉快的氣味有較強的相關性。綜上所述，4個牧場牛奶樣品感官差異明顯，未經(jīng)訓練的小組成員可以很好地將其進行區(qū)分。
        02 4個牧場牛奶風味物質的GC-MS分析
        采用HS-SPME-Arrow-GC-MS初步分析造成4個牧場牛奶樣品感官差異的揮發(fā)性風味物質，圖3A清楚地顯示了4個牧場牛奶樣品的揮發(fā)性風味物質數(shù)量，共鑒定出37種揮發(fā)性物質，包括酸類11種、酮類3種、醇類11種、醛類6種、酯類2種以及萜烯類2種、含硫化合物1種和酚類物質1種。一牧和二牧的風味物質比三牧和四牧多，4個樣品被檢測出17種相同的成分。將4個樣品中風味物質的種類通過含量進行比較，如圖3B所示?？梢钥闯?，一牧牛奶樣品風味物質釋放含量明顯高于其他3個牧場，三牧和四牧樣本間的差異相對較小。其中一牧的酸類和酮類物質含量最高，牛奶中的酸類物質來源于脂肪分解、乳糖和氨基酸的降解，而牛奶中的揮發(fā)性脂肪酸一般是指含偶數(shù)碳的中短鏈脂肪酸，如丁酸、己酸、辛酸等。此外，酸類除了能夠作為揮發(fā)性物質外，還是酮類化合物的前體物質，酮類主要由熱加工過程中的脂肪降解和游離脂肪酸經(jīng)氧化為β-酮酸后脫羧反應產(chǎn)生。二牧中的醛類化合物含量在4個樣品中最高，牛奶中的醛類化合物主要來源于脂肪酸代謝、氨基酸轉氨作用或Strecker降解。醇類和酯類在所有樣品中均較少，牛奶中的醇類物質可能來源于化學降解，也可能是由于微生物的活動產(chǎn)生的，醇類的風味閾值較醛類高，因此對風味的影響較醛類物質低。
        為更直觀地分辨4個牛奶樣品間的差異，基于其風味物質的定性定量結果，對樣品進行主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）（圖3C），PC1和PC2分別解釋了55.6%和29.3%的方差，兩個PC總方差貢獻大于80%，可以基本反映樣品整體信息。不同樣品在PC1上有較大差異。三牧和四牧在PC1上投影較近，揮發(fā)性風味物質較為相似，一牧、二牧則與上述兩個樣品相距較遠，表明揮發(fā)性風味物質差別較大。與一牧相關的揮發(fā)性物質最多，均存在PC1的負軸上，如中短鏈脂肪酸、2-庚酮、壬醛等。而二牧與3-己醇、辛醇、糠醛、苯乙烯、苯甲酸等物質距離較近。三牧和四牧與2-戊醇、檸檬烯、己醛、苯乙酮等揮發(fā)性物質聚集在一起。其中乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、己醛、檸檬烯、苯乙烯在韓兆盛等的研究中也有發(fā)現(xiàn)，因此，這可能是造成牛奶感官差異的風味物質。         03 4個牧場牛奶香氣活性物質的GC-MS-O分析
        基于GC-MS從牛奶樣品中共鑒定出37種揮發(fā)性風味物質，為進一步確定引起4個牧場牛奶樣品感官差異的主要香氣活性物質，本研究進一步采用GC-MS-O技術從中分析出AI≥1的14種氣味活性物質，并通過標準曲線計算這些香氣活性物質在牛奶中的精確含量（表4），其中包括酸類7種（乙酸、丁酸、己酸、辛酸、壬酸、癸酸、十二酸）、酮類2種（2-庚酮和苯乙酮）、醛類2種（己醛和癸醛）、醇類1種（1-辛烯-3-醇）以及萜烯類2種（檸檬烯和苯乙烯）。         為更清晰地了解4個牧場牛奶樣品香氣活性物質濃度的異同，對4個牧場牛奶樣品的14種香氣活性物質的精確定量結果進行熱圖和層次聚類分析，結果如圖4所示。橫向代表不同樣品間的濃度差異，縱向聚類結果代表14種成分間的濃度差異關系，熱圖顏色由藍至紅反映各成分濃度由低至高。4個牧場牛奶樣品熱圖聚類分析結果顯示，一牧牛奶樣品聚為第一類，說明一牧牛奶樣品的香氣活性物質分布不同于其他3個牧場，這主要與其短鏈脂肪酸含量顯著高于其他3個牧場有關（P＜0.05）。它們分別為乙酸（AI＝1.5，63.55?μg/kg）、丁酸（AI＝2，22.31?μg/kg）、己酸（AI＝2，51.06?μg/kg）、辛酸（AI＝2.5，125.55?μg/kg）、壬酸（AI＝1.5，8.79?μg/kg）、癸酸（AI＝2.5，72.21?μg/kg），這些脂肪酸廣泛存在于牛奶中，其中丁酸在低濃度下具有較為濃郁的奶香味，此外，苯乙酮（AI＝1，24.82?μg/kg）在一牧中的含量也最高，苯乙酮由苯基丙氨酸的β-氧化形成酮酸后經(jīng)脫羧生成，且苯乙酮與奶酪的香氣強度呈正相關。二牧聚為第二類，其中的十二酸（AI＝1，27.72?μg/kg）和檸檬烯（AI＝2.5，20.26?μg/kg）含量顯著高于其他牧場（P＜0.05），這可能是引起差異的主要香氣活性物質，萜烯類化合物通常具有水果味、草本味或樹脂味，F(xiàn)ernandez-Garcia等報道了法國高原地區(qū)采集的牛奶中萜烯類濃度均高于平原地區(qū)。因此4個牧場牛奶樣品間萜類物質濃度的差異可能是由于地區(qū)不同。三牧和四牧聚為第3類，表示其香氣活性物質分布整體上沒有顯著差異，這與兩者的香氣活性物質含量普遍偏低有關。但從表4的定量結果可以得出己醛（AI＝2，52.89?μg/kg）和癸醛（AI＝1，36.06?μg/kg）在三牧中的含量均最高，醛類化合物在低濃度時，會產(chǎn)生令人愉悅的草本氣味，且1-辛烯-3-醇是嗅聞得到唯一的醇類物質且僅在三牧中出現(xiàn)，它具有典型的蘑菇香氣，超過適當?shù)臐舛人剑瑫古Ｄ逃薪饘傥?。以上聚類結果與圖3C結果一致，表明這14種香氣活性物質是引起4個牧場牛奶感官差異的主要貢獻者。         04 牛奶樣品香氣活性物質與感官特性的相關性分析
        基于PLSR的模型分析氣味CATA變量（Y變量）與香氣活性物質（X變量）之間的相關性。PLSR結果如圖5所示。僅使用樣本間差異顯著的氣味CATA變量進入模型。雙組分R2X（cum）值在0.630～0.807之間，R2Y（cum）值在0.788～0.968之間。PLSR模型中的Q2值用于揭示氣味屬性（Y變量）和化合物（X變量）之間的相關性。結果顯示：一牧奶香味和奶油味較為明顯，這是令人愉悅的氣味特征，與短鏈脂肪酸類化合物，如丁酸、己酸、辛酸、癸酸以及2-庚酮等相關性較大，艾娜絲等在分析全脂巴氏乳揮發(fā)性成分中得到了相似的結果；二牧具有香甜味，與檸檬烯相關性較大，也是令人愉悅的氣味；三牧具有塑料味、奶腥味、金屬味的氣味特性，其中金屬味與1-辛烯-3-醇相關性較大，與潘明慧等的研究結果一致。四牧的蒸煮味較強，與苯乙烯、己醛的相關性較大，在Hedegaard等對3種不同脂肪酸組分的牛奶的研究中同樣也發(fā)現(xiàn)蒸煮味與己醛高度相關。此外，三牧和四牧喜好度評分較低，己醛、苯乙烯、1-辛烯-3-醇與其有較大的相關性，這些物質可能是令人不愉快的氣味來源。         來源：感官科學與評定
        參考文獻：韓顥穎，王亞東，韓兆盛，王蓓，付翠霞，趙爽，喬琳雅，姚歡. 基于CATA和GC-MS-O的不同牧場牛奶感官特性及香氣活性物質分析[J]. 食品科學, 2024, 45(1): 143-149.
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